2010-2023年ROS文章统计（来源于Medeading）

03检测方法

目前有多种方法用于检测ROS，包括荧光染色法、电子顺磁共振技术（EPR）、化学发光法、色谱法、分光光度法、电化学生物传感器以及基于荧光蛋白等七种。在这里，我们将着重介绍荧光染色法，以及其在检测细胞内ROS时的原理和操作步骤。

04检测原理

目前，用于检测细胞内ROS最广泛采用的方法是DCFH-DA荧光探针法。DCFH-DA（二氯荧光黄双乙酸盐）是一种可指示的探针，其本身不具有荧光，但可以自由穿过细胞膜。一旦进入细胞，它会被细胞内的酯酶水解成DCFH。由于DCFH无法穿过细胞膜，因此荧光探针会在细胞内积聚。细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH，生成有荧光的DCF，且荧光强度与ROS水平成正比。通过荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等设备，在最大激发波长480nm和最大发射波长525nm下检测荧光信号。

活性氧阳性诱导药物Rosup的荧光信号强度可用于分析细胞内活性氧的实际水平。这种方法提供了一种直观而灵敏的手段，通过检测荧光信号，我们能够准确评估细胞内ROS水平，为进一步研究细胞活动和疾病机制提供了重要的信息。

DCFH-DA探针在细胞内的作用机制（图片来源于网络）

05实验流程

（1）装载探针

1、先用无血清培养基稀释阳性对照（Rosup,100mM）到常用工作浓度100μM，对于刺激时间较短的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照（Rosup）或自己感兴趣的药物刺激细胞。

2、对于刺激时间较长的细胞，先用活性氧阳性对照（Rosup）或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

（原位装载探针：仅适用于贴壁细胞）

1、细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞密度达到50~70%。

2、移除培养液，添加适量药物，以适当的缓冲液或无血清培养基稀释，于37℃细胞培养箱内避光孵育。

3、探针装载：使用1:1000稀释DCFH-DA，最终浓度为10μM。去除诱导药物，添加适量的DCFH-DA工作液，覆盖细胞表面。

4、细胞清洗：用无血清培养基洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

（收集细胞后装载探针：适用于贴壁细胞和悬浮细胞）

1、准备细胞：按标准方法培养和清洗细胞，确保细胞状态健康。

2、诱导：将细胞悬浮于适量的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育。

3、探针装载：去除上清，收集细胞，添加10μM的DCFH-DA探针，确保细胞表面覆盖。

4、清洗细胞：使用无血清培养基洗涤细胞1~2次，完全去除未进入细胞的DCFH-DA。

（2）检测

1、原位装载探针法：使用激光共聚焦显微镜直接观察，或使用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

2、收集细胞后装载探针：使用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以使用激光共聚焦显微镜直接观察。

注意事项

1、在完成探针装载后，务必充分清洗，去除未进入细胞的探针残余，以避免引发高背景信号。

2、探针装载和清洗完成后，可执行激发波长和发射波长的扫描，确保探针装载状况良好。

3、为降低各类误差，建议尽量缩短探针装载后至测定时的时间（刺激时间除外）。返回搜狐，查看更多